上皮細胞培養應該注意什么-上皮細胞-生物學習資料
編輯： admin 2017-01-03
-
4
上皮細胞培養1)表皮細胞培養1.取材：取外科植皮或手術殘余皮膚小塊,以角化層薄者為佳,早產流產兒皮膚更好,切成0.5～1 平方厘米小塊.2.EDTA 處理：先置入0.02%EDTA 中室溫置5 分鐘.3.冷消化：換入0.25%胰蛋白酶中,置4℃過夜.4.分離：取出皮膚,用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開.5.溫消化：取出表皮單獨處理,用剪刀剪成更小的塊后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30～60 分鐘.6.用吸管輕輕反復吹打,使成細胞懸液.7.培養液：通過80 目不銹鋼紗網濾過后,低速離心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,制成細胞懸液,接種入碟皿中,CO2 溫箱培養.2) 乳腺組織培養直接培養法：(適于培養含纖維少的軟組織)1.在含有少量培養液或Hanks 液的容器中,用鋒利刀片將組織反復切割成碎塊.2.把組織碎塊連同液體注入離心管中,再補加少許培養液,用吸管吹打片刻,置試管架3～5 分鐘.吸除上層液可排除非乳腺細胞部分.重復2～3 次.3.末次處理結束后,向沉降管中再補加培養液,用吸管稍吹打,使沉降物重懸.不待細胞團塊下降立即通過3～4 層無菌紗布濾入另管中.4.調整好適宜密度,接種入培養瓶中培養.膠原酶消化法：(適于處理含纖維多的較硬組織)其過程與培養其它組織相同.3) 胃上皮細胞培養1.取材：取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區粘膜少許.2.清洗：用含慶大霉素(400 微克/毫升)和二性霉素(2 微克/毫升的Hanks)液漂洗后,用鈍器剝離下粘膜,剪成1mm3 大小.3.消化：在I 型膠原酶和透明質酸酶中,于37℃中消化80 分鐘.4.離心：收集細胞懸液,800 轉/分離心后,Hanks 液漂洗兩次.5.接種：末次離心后加入含有1%～2%胎牛血清的完全培養基,接種入不同孔數的培養板中,接種量依不同實驗目的而定.4) 肝細胞培養初代組織塊培養：取新鮮肝臟,先剝除被膜和血管等纖維成分,用刀或剪刀把肝臟剪成1mm3 左右的小塊,采用帖壁培養法.初代消化法培養：1.把肝組織切成2～4 立方毫米的小塊,用不含鈣鎂的BSS 液洗兩次.2.移入1：1 的0.1%胰蛋白酶和0.1%膠原酶(都用無鈣鎂BSS 配置)中,4℃冷消化10～12 小時后,通過250 微米和64 微米尼龍網或不銹鋼紗網濾過.3.收集細胞、BSS 液洗1～2 次、計數、接種培養.消化培養肝細胞的另一種方法是灌流法(肝臟灌流需用全肝,以較小動物如小鼠和大鼠為好)：1.無菌解剖動物,取出肝臟,先用BSS 洗除血污.2.取5ml 注射器一支,吸取消化液后,把注射器頭輕輕插入肝管中,用線繩結扎牢固,以防消化液漏出,輕輕把消化液注入肝管系統,并不時輕揉壓肝臟,以便消化液進入肝小葉中;消化液在肝內停留20～30 分后,在吸出消化液的同時并輕揉壓肝臟,以使肝細胞脫落和消化液吸出.3.待吸凈消化液后,注入離心管中,低速離心分離,用RPMI 1640 培養基培養(較其它培養基為好),能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果.傳代培養：待細胞生長連接成片后,用BSS 洗一二次,加1：1 的0.025%胰蛋白酶和0.02% EDTA 混合消化3～5 分鐘,待細胞回縮,便停止消化,棄掉消化液,用BSS洗一二次,注入營養液,吹打,制成細胞懸液,再接種培養.5)內皮細胞培養1.取產后的新鮮臍帶.如不立即培養可以保存于4℃中,但不宜超過12 小時.無菌剪取長10～15 厘米一段.其它如胚胎和幼體動物的大血管,亦可用于培養.2.先用三通注射器吸溫PBS 液注入臍帶的靜脈中,洗除殘血,注入口處宜用線繩結扎,以防液體返流.3.用血管鉗夾緊臍帶一端,從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為0.1%的膠原酶,待末端出現液體后結扎之,令充滿血管,注入口亦應結扎,以防液體返流,消化3～10 分鐘.4.吸出含有內皮細胞的消化液,注入離心管中,為獲取更多細胞,可再注入溫PBS 沖洗2～3 次徹底清除干凈殘余細胞,一并注入離心管中離心.5.吸除上清,加1640 培養液,制成細胞懸液,接種入瓶皿中培養,順利時2～3 天內細胞即可長成單層.6)毛細血管內皮細胞培養腫瘤條件培養基制備：1.取C3H 小鼠的S-180 實體肉瘤組織.2.胰蛋白酶消化,Dulbecco 改良Eagle 氏培養液15ml(含10%小牛血清),接種到T-75 Falcon 產培養瓶中培養.3.在細胞生長接近完全匯合時,收集培養液制成條件培養基;再用含10%小牛血清的新培養液后,也每隔兩天收集一次,可獲得多量條件培養基.4.4000 轉/分離心后,再通過0.22μm 微孔濾膜濾過,-20℃凍存備用(臨用前融解).初代培養：1.取材：取新鮮牛腎上腺數個,先用Hanks 液洗除血污.2.剝除被膜,分離出皮質,切成1 立方毫米小塊,加0.5%膠原酶室溫中消化1 小時,每隔10 分鐘用吸管吹打懸液令消化充分.3.通過不銹鋼紗網濾過,網眼要求只允許能通過小于110 微米長的毛細血管小段.4.650rpm,4℃,離心7 分鐘后,棄掉上清膠原酶.5.沉淀物用培養液重懸并離心,再重懸,再離心,共兩次.6.末次沉淀物仍用含有10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培養液重懸后,稍吹打.7.接種于鋪有明膠底層的培養皿中,37℃培養,在培養頭1～3 小時中,毛細血管小段和內皮細胞最先帖附于底物上,而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養液中漂浮.8.趁此時,吸除培養液,再加入腫瘤條件培養液,每兩天換液一次.毛細血管小段一般成自1～4 個內皮細胞,以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態的細胞島,能持續2～5 天.毛細血管內皮細胞分離培養：1.初代培養2～3 天后,鏡下確認幾個毛細血管內皮細胞島,在培養皿背面,用不脫色筆劃圈圈起.2.鏡下檢查,如圈內殘有非內皮細胞時,可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除.此操作用細胞解剖器或用手操作均可,宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養皿蓋進行,但時間不宜過長(15～20 分鐘),圈內非內皮細胞可用無菌膠刮除.3.用培養液漂洗兩次,以去除漂浮細胞.4.剩余內皮細胞島如小(5～20 個細胞)而少時,生長增值變得緩慢或不完全不生長,此時需加入3T3 等飼細胞,飼細胞接種量為4000 細胞/cm2.5.當內皮細胞充滿所有飼細胞空間后,用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養基.6.接種入明膠底物皿中繼續培養(飼細胞死亡淘汰),細胞增殖生長匯合后,按1：5 傳代. 樓主以后想要查找這方面的信息,可以到生物幫那里,我那里的信息挺全面的,信息內容豐富、科學、專業.有空個可以去 www.bio1000.com/zt/cell/201378.html 那里看下,會有幫助的.
類似問題
類似問題1：上皮細胞培養應該注意什么[生物科目]
博凌科為生物科技-為你用乳腺細胞培養上皮細胞時的注意事項：①盡可能去除脂肪組織,用無鈣,鎂離子的PBS清洗（200U/ml青霉素,200ug/ml鏈霉素）3～5次,將組織剪成碎塊,移入離心管,用吹管吸打分散,靜置3～5min,使乳腺細胞及細胞團塊沉積管底,脂肪,纖維等碎塊懸浮上層,吸除上層液,補加洗液重復3～5次,最后用培養基重懸細胞,用3～4層無菌紗布過濾,調整細胞密度后分瓶培養.②如果標本中纖維組織較多,可用膠原酶消化法獲取細胞.③開始有巨噬細胞存在,可作滋養細胞,隨著上皮細胞的生長和克隆形成,巨噬細胞逐漸消失.④培養時可用經照射或用絲裂霉素C處理過的3T3細胞作飼養層細胞.也可用膠原層,既利于上皮細胞生長,又利于從底層分離.⑤培養基中也可加刺激生長因子如EGF,胰島素,氫化可的松,豬促乳素和前列腺素E1等,有利于細胞生長繁殖.
類似問題2：如何采集宮頸上皮細胞,應該注意哪些?
用棉簽處理好外部,準備好擴陰器、一次性宮頸取樣刷,在子宮頸口順時針旋轉5圈左右取出放到液基保存液中,應該注意的是要處理好擦洗粘液,取樣刷旋轉的力度,避免出血,更多相關的信息可咨詢北京達希醫療的網站查看.
類似問題3：用乳腺細胞培養上皮細胞時需注意什么[生物科目]
博凌科為生物科技-為你用乳腺細胞培養上皮細胞時的注意事項：①盡可能去除脂肪組織,用無鈣,鎂離子的PBS清洗（200U/ml青霉素,200ug/ml鏈霉素）3～5次,將組織剪成碎塊,移入離心管,用吹管吸打分散,靜置3～5min,使乳腺細胞及細胞團塊沉積管底,脂肪,纖維等碎塊懸浮上層,吸除上 層液,補加洗液重復3～5次,最后用培養基重懸細胞,用3～4層無菌紗布過濾,調整細胞密度后分瓶培養.②如果標本中纖維組織較多,可用膠原酶消化法獲取細胞.③開始有巨噬細胞存在,可作滋養細胞,隨著上皮細胞的生長和克隆形成,巨噬細胞逐漸消失.④培養時可用經照射或用絲裂霉素C處理過的3T3細胞作飼養層細胞.也可用膠原層,既利于上皮細胞生長,又利于從底層分離.⑤培養基中也可加刺激生長因子如EGF,胰島素,氫化可的松,豬促乳素和前列腺素E1等,有利于細 胞生長繁殖.
類似問題4：“人的口腔上皮細胞” 在實驗中應注意實驗安全,例如,( )等.
牙簽~~~
類似問題5：制作人體口腔上皮細胞的注意事項.制作人體口腔上皮細胞時,要在載玻片中間滴一滴生理鹽水,目的是保持細胞原形態,視野要調得（ ）,光圈要調得（ ）.[生物科目]
調暗,小.理由：人的口腔上皮細胞較薄,透光性較強,因此要合理利用光色對比性,即細胞顏色淺的視野要暗,顏色深視野要亮,光圈大小與視野亮暗成正比.