蛋白質的分離純化技術有哪些？盡量全面一點，-蛋白技術
編輯： admin 2017-12-03
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蛋白質的分離純化方法很多,主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質的溶解度增加,此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時,蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質溶液中,高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO4 和 NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質分子的水化層,使之“失水”,于是蛋白質膠粒凝結并沉淀析出.鹽析時若溶液 pH 在蛋白質等電點則效果更好.由于各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉淀.
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4 度）操作外,一般可在室溫中進行.一般溫度低蛋白質溶介度降低.但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25 度）比 0 度時溶解度低,更容易鹽析.（2）pH 值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低.（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時,欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉淀出來（共沉現象）.因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質含量在 2.5-3.0%.蛋白質鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等.其中應用最多的硫酸銨,它的優點是溫度系數小而溶解度大（25 度時飽和溶液為 4.1M,即 767 克/升；0 度時飽和溶解度為 3.9M,即 676 克/升）,在這一溶解度范圍內,許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質變性.硫酸銨溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之間,當用其他 pH 值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調節.蛋白質在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常
用的是玻璃紙）,用緩沖液進行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行.此外也可用葡萄糖凝膠 G-25 或 G-50 過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短.
2、等電點沉淀法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質的等電點有差別,可利用調節溶液的 pH 達到某一蛋白質的等電點使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用.
3、低溫有機溶劑沉淀法
用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行.
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開.超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質分子通過半透膜,而蛋白質留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質.
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一.柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）.
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同 pH 環境中帶電性質和電荷數量不同,可將其分開.
1、電泳法
各種蛋白質在同一 pH 條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開.值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質作為載體,電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的 pH 梯度,當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時,到達各自等電點的 pH 位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質.
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素）,當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上,隨后用改變 pH 或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來.
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法,它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來,而且純度很高.這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合.其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質,因此蛋白質的分離（Separation）,提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質
從復雜的混合蛋白質中提取出來,因此往往采取幾種方法聯合使用.
提示：
萊特萊德為你解答，蛋白質的分離純化工作較為復雜，從細胞中提取的蛋白質或從含有蛋白質的溶液中經過沉淀、梯度離心、鹽析等方法得到的蛋白質經常含有雜質，要去除這些雜質，同時又要保持蛋白質的生物學活性，如酶的催化活性，就需要根據不同的蛋白質制定出相應的策略，采用不同的方法。電泳和色譜法是比較常用的方法，尤其是色譜法，對蛋白質的處理較為溫和，又可大量制備有生物學活性的純化蛋白質，因此是目前最為廣泛應用的技術方法。
離子交換色譜法（ion exchange chromatography,IEC）是根據物質的酸堿度、極性和分子大小的不同進行分離的技術，通常包括吸附、吸收、擴散、穿透、靜電引力等復雜的物理化學過程。自然界的包括蛋白質在內的生物大分子都帶有電荷，當所需分離的物質通過離子交換色譜柱時，由于所帶電荷、分子量等不同，有些被固定相靠靜電引力所吸附，未被吸附的物質可被緩沖液首先洗脫出來；被吸附的物質由于所帶電荷多少不同，對固定相的親和力大小也不同，可被梯度離子緩沖液先后洗脫下來，使同一溶液中的不同物質被分離。色譜柱中填充的陰離子交換劑可用于帶正電荷物質的分離，而陽離子交換劑可用于帶負電荷物質的分離。
類似問題
類似問題1：蛋白質分離純化技術中哪些與它的等電點有關?試述這些技術分離純化的原理?
主要有：
等電聚焦：使電泳的介質中形成一定范圍的pH梯度,電泳時待分離的兩性分子可以在這種pH梯度中遷移,直到聚集于與其等電點相同的區域.該技術特別適用于分子量相近而等電點不同的蛋白質分離和分析.
等電點沉淀：利用兩性電解質在等電點時溶解度最低,以及不同兩性電解質等電點不同的特性,通過調節溶液PH,使蛋白質或雜志沉淀析出,從而使蛋白質與雜質分離.
層析聚焦：將蛋白質等兩性電解質的等電點的特性和層析的特性結合在一起,實現分離的技術.
等電點結晶：通過緩慢改變蛋白質溶液的PH,使之逐漸達到等電點,而使蛋白質結晶析出,從而得到純化.
類似問題2：求蛋白分離純化步驟[生物科目]
蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：
（一）材料的預處理及細胞破碎
分離提純某一種蛋白質時,首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態,不喪失活性.所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎.常用的破碎組織細胞的方法有：
1.機械破碎法
這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎.常用設備有,高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等.
2.滲透破碎法
這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎.
3.反復凍融法
生物組織經凍結后,細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破.這種方法簡單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法.
4.超聲波法
使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎.
5.酶法
如用溶菌酶破壞微生物細胞等.
(二)蛋白質的抽提
通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來.抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定.如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100 等）,使膜結構破壞,利于蛋白質與膜分離.在抽提過程中,應注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質的變性.
（三）蛋白質粗制品的獲得
選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來.比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離.常用的有下列幾種方法：
1.等電點沉淀法
不同蛋白質的等電點不同,可用等電點沉淀法使它們相互分離.
2.鹽析法
不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉淀析出.被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質,并能再度溶解而不變性.
3.有機溶劑沉淀法
中性有機溶劑如乙醇、丙酮,它們的介電常數比水低.能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低,進而從溶液中沉淀出來,因此可用來沉淀蛋白質.此外,有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層,促使蛋白質分子變得不穩定而析出.由于有機溶劑會使蛋白質變性,使用該法時,要注意在低溫下操作,選擇合適的有機溶劑濃度.
（四）樣品的進一步分離純化
用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質,須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品.常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等.
有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品.
類似問題3：蛋白質的分離純化有哪些技術
蛋白質分離純化的方法有多種,主要有層析技術,凝膠電泳技術.層析又有離子交換層析,親和層析等
類似問題4：蛋白質分離純化的5種方法主要有什么?[生物科目]
蛋白質分離純化常用方法有：
1、沉淀,
2、電泳：蛋白質在高于或低于其等電點的溶液中是帶電的,在電場中能向電場的正極或負極移動.根據支撐物不同,有薄膜電泳、凝膠電泳等.
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法.
4、層析：
a.離子交換層析,利用蛋白質的兩性游離性質,在某一特定PH時,各蛋白質的電荷量及性質不同,故可以通過離子交換層析得以分離.如陰離子交換層析,含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來.
b.分子篩,又稱凝膠過濾.小分子蛋白質進入孔內,滯留時間長,大分子蛋白質不能時入孔內而徑直流出.
5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量.不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開.
類似問題5：蛋白質分離純化常用方法[生物科目]
蛋白質分離純化常用方法有：
1、沉淀,
2、電泳：蛋白質在高于或低于其等電點的溶液中是帶電的,在電場中能向電場的正極或負極移動.根據支撐物不同,有薄膜電泳、凝膠電泳等.
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法.
4、層析：
a.離子交換層析,利用蛋白質的兩性游離性質,在某一特定PH時,各蛋白質的電荷量及性質不同,故可以通過離子交換層析得以分離.如陰離子交換層析,含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來.
b.分子篩,又稱凝膠過濾.小分子蛋白質進入孔內,滯留時間長,大分子蛋白質不能時入孔內而徑直流出.
5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量.不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開.